DMD 是一種嚴(yán)重的肌肉退化性疾病，由導(dǎo)致肌營養(yǎng)不良蛋白基因移碼的基因組突變引起。外顯子跳躍是一種很有前途的恢復(fù)肌營養(yǎng)不良蛋白的方法，而 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)則作為一種新興方法出現(xiàn)。
然而，誘導(dǎo)大缺失以覆蓋分布在數(shù)百個(gè)堿基上的目標(biāo)外顯子的技術(shù)有限。
關(guān)于該研究
本研究評估了 CRISPR-Cas3 系統(tǒng)作為 DMD 患者的基因組編輯工具。
針對 Cas3 開發(fā)了基于雙色單鏈退火 (SSA) 的報(bào)告系統(tǒng)，以增強(qiáng)基因編輯的細(xì)胞，然后進(jìn)行距離分析。
Cas3-CRISPR RNA (crRNA) 的多重作用導(dǎo)致了基因組 MES。研究了在 DMD 誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中誘導(dǎo) MES 的最佳 crRNA 配對，并設(shè)計(jì)了一種富集基因組編輯細(xì)胞的報(bào)告方法。
為了研究脫靶誘變的可能性，對基因編輯的克隆進(jìn)行了全基因組測序 (WGS)，然后研究了與潛在 CRISPR RNA 結(jié)合區(qū)域相關(guān)的缺失。
一對向內(nèi)夾著目標(biāo)基因組區(qū)域的 crRNA 用于分析。使用適用于雙 Cas3 的 SSA 報(bào)告載體系統(tǒng)豐富了雙 Cas3 方法。
研究小組還在人胚腎 (HEK)293T 細(xì)胞中測試了間隔為 344 kb 的內(nèi)向雙 Cas3 誘導(dǎo)的缺失模式。插入包含 CRISPR RNA 檢測區(qū)域的長間隔區(qū)(0.5 至 1.7 kb)的序列，以將目標(biāo)基因序列延伸至 Cas3 缺失。
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