表觀遺傳化學(xué)探針在非腫瘤學(xué)研究中的應(yīng)用

干細胞分化

人們越來越意識到表觀遺傳調(diào)節(jié)在干細胞編程中的重要性。以下是使用表觀遺傳探針進行的干細胞研究的一些示例。Lee 等人 [PMID：27625395] 將 miR-221 基因編碼的 miR-221-3p 和 miR-221-5p 作為潛在的抗干細胞性 miRNA。在一項由Chen 等人進行的隨后研究中， PRMT7 介導(dǎo)的 microRNA-24-2 下調(diào)能維持小鼠胚胎干細胞 (mESC) 中的 Oct4、Nanog 和 Sox2 [PMID: 29378844]。通過一項報告基因分析和多項突變研究，Chen 等人發(fā)現(xiàn) miR-221 能靶向 Oct4、Nanog、SOX2、Klf4 和 PRMT7 的 3’UTR。CRISPR 介導(dǎo)的 miR-221 基因刪除以及 miR-221-3p 和 miR-221-5p 的特定反義抑制劑抑制了 PRMT7 缺失型小鼠 ESC 的自發(fā)分化。此外，當(dāng) PRMT7 缺失時，miR-221 啟動子處的抑制性標(biāo)記 H4R3me1 和 H4R3me2 也減少(使用兩種不同的 shRNA)。

骨骼肌重塑

已使用表觀遺傳化學(xué)探針來研究骨骼肌重塑，結(jié)果表明 PRMT1 不僅參與成肌細胞分化，還參與線粒體合成和代謝。Shen 等人研究了 PRMT1、PRMT4 和 PRMT5 在 7 天肌生成期間內(nèi)的基因和蛋白表達 [PMID：29208765]。通過已建立的組織學(xué)和分子標(biāo)記物法成肌，作者首次證實，正如預(yù)期的一樣，C2C12 細胞在 7 天時間內(nèi)從單核成肌細胞發(fā)展成強健的肌管細胞。作者發(fā)現(xiàn)PRMT1 mRNA 會顯著增加(在第 5 天達到峰值)，而 PRMT4 和 PRMT5 轉(zhuǎn)錄水平則保持不變。此外，蛋白表達與轉(zhuǎn)錄水平相符。在這段時間內(nèi)，PRMT4 和 PRMT5 的表達平穩(wěn)無變化，而 PRMT1 的表達在肌生成的第 3 天至少翻了兩倍，且持續(xù)增加，直到第 7 天。

Shen 等人還檢測了總體的單甲基精氨酸 (MMA)、非對稱和對稱二甲基精氨酸(ADMA 和 SDMA)以及特定組蛋白底物的甲基化。ADMA 在第 3 天增加了 1.7 倍，且持續(xù)增加，而 MMA 和 SDMA 則保持不變。在第 7 天，與成肌細胞相比，PRMT1 底物 H4R3me2a 和 H3R17me2a 高出約 2 倍，而 H3R8me2s 狀態(tài)則保持不變。使用 0.1 μM 的 TC-E 對 PRMT1 進行化學(xué)抑制不會影響細胞 H4，但會使 H4R3me2a 的水平下降 25%，以及降低所有與第 3-7 天肌生成相關(guān)的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。在這段時間內(nèi)，線粒體電子傳遞鏈 CI、CIII、CV 和 PGC-1α 減少了約 20-40%，而 CII 則保持不變。最終，相對于載體對照，在有抑制劑的情況下，第 3-7 天的耗氧量減少了 20-35%。

破骨細胞和骨重塑

破骨細胞 (OC) 在骨重塑、修復(fù)和礦物質(zhì)維持中起著重要作用。在 RANKL 誘導(dǎo)的 RAW264.7 巨噬細胞的 OC 分化期間，DOT1L 表達和隨后的 H3K79 甲基化增加 [PMID：29348610]。相對于 RAW264.7，使用 EPZ 004777 或 EPZ5676 對 DOT1L 進行化學(xué)抑制會導(dǎo)致 RAW264.7 衍生的 OC 中的 H3K79me2 整體減少。在 RAW264.7 細胞中，有證據(jù)顯示 H3K27 和 H3K36 甲基化實際上會增加，而在 OC 中，僅 H3K36 甲基化會輕微增加。此外，自噬相關(guān)蛋白 SNARE、Sqstm1、VPS35 和 Atg3 在 40 小時的 OC 前細胞中被上調(diào);一項商業(yè)檢測和針對自噬體標(biāo)志物的蛋白印跡實驗確實證實了自噬活性會增加。

在一項相關(guān)研究中，Kota 等人 [PMID：30189247] 通過在穩(wěn)態(tài)下處理間充質(zhì)基質(zhì)細胞系或用 EPZ015666 (0.6-1.4 μM) 進行成骨分化來抑制 PRMT5。對PRMT5 的抑制會增強成骨細胞分化和下調(diào)數(shù)種 Gbp(鳥苷酸結(jié)合蛋白)家族基因。這會導(dǎo)致干擾素刺激基因位點啟動子處的 H3R8me2 和 H4R3me2 出現(xiàn)總體下降以及啟動子特異性下降。

人體骨骼的強度和完整性取決于破骨細胞骨吸收和成骨細胞骨形成之間的微妙平衡。BRPF 支架蛋白經(jīng)證實會抑制破骨細胞生成轉(zhuǎn)錄所需的程序，從而參與 RANKL 誘導(dǎo)的原代小鼠骨髓細胞和人體原代單核細胞分化成骨吸收破骨細胞的過程 [PMID：28849908]。

心臟祖細胞分化

DOT1L 還在心臟祖細胞的分化中起著重要作用 [PMID：29631608]。在 hESC 分化成心臟祖細胞和心肌細胞期間，ChIP 檢測到 GATA4、HAND1、NR2F2、NKX2.5、MESP1、ISL1 和 WNT5A 上有 DOT1L 特異性標(biāo)記 H3K79me2。KIND1 和 HES3 分化表明 DOT1L 與主要心臟轉(zhuǎn)錄因子 NKX2.5 共定位(在多能性階段之后以及在分化成心臟祖細胞和心肌細胞期間)。對 DOT1L 進行 siRNA 敲減不會影響 hES 的多能性，但會影響分化成為心臟細胞系。這在形態(tài)學(xué)上以及在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平下得到證實。作者確認，DOT1L 可能與其他組蛋白修飾酶共同發(fā)揮作用，因為 H3K4me3 和 H3K36me3 經(jīng)證實還參與了心臟祖細胞的分化。

炎癥中的表觀遺傳學(xué)

炎癥機制失調(diào)有害，且是哮喘、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、過敏性濕疹、牙周炎和炎性腸病等常見慢性病的根本原因。下文總結(jié)了數(shù)篇在炎癥相關(guān)研究中使用化學(xué)探針的近期文獻。

BET 抑制劑在各種炎癥模型中均顯示具有積極作用。由于現(xiàn)有的 BET 拮抗劑無法區(qū)分不同的 BET 家族成員，因此許多研究都無法提供關(guān)于 BRD4 相對于 BRD2 或 BRD3 的生物功能的明確結(jié)果。近期出版物包括一項體內(nèi)研究，在該研究中，BET 溴區(qū)結(jié)構(gòu)域抑制劑 JQ1 減少了由脊髓損傷引起的急性炎癥 [PMID：30134146]。由 GSK4027 相關(guān) PROTAC 引起的 PCAF/GCN5 降解(而非 GSK4027 引起的拮抗)表明，其在單核細胞分化成巨噬細胞和樹突細胞的過程中發(fā)揮作用 [PMID：30200762]。

PRMT 和 PKMT 還在炎性反應(yīng)中起作用。PRMT1、PRMT4、PRMT5 和 PRMT6 在癌癥及其轉(zhuǎn)移相關(guān)的炎癥、哮喘和抗原誘導(dǎo)的肺氣道疾病、對感染的反應(yīng)、移植排斥、糖尿病和炎性腸病中都起著不同的作用 [PMID：27860244、28087667、29119338、27840030、27860244 和 29973649]。DOT1L、PRC2 復(fù)合體、G9a 和 SMYD3 等 PKMT 通過 DOT1L 抑制劑 EPZ5676 和 SGC0946 參與先天免疫應(yīng)答 [PMID：30275539、29765028]、及用 EZH2 抑制劑 UNC1999 和 GSK503 進行 T 細胞抗原受體 (TCR) 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo) [PMID：29523590]、通過 G9a 基因敲除來調(diào)節(jié)炎癥的肝臟特異性基因 [PMID：29912608]，還參與調(diào)節(jié)肺部病毒感染期間的致病性 T 細胞應(yīng)答 [PMID：25669152]。

病毒研究表觀遺傳學(xué)

流感病毒的 RNA 會與其核蛋白 (NP) 發(fā)生相互作用，其核蛋白的功能與真核細胞中的組蛋白相似。Hatakeyama 等人發(fā)表的一篇出版物 [PMID：29555684] 通過兩種宿主細胞乙?；D(zhuǎn)移酶 PCAF 和 GCN5 分別在 K31 和 K90 處來鑒別病毒 NP 乙?；?。靶向 PCAF 和 GCN5 的 siRNA 不會影響 NP 乙?；剑珪Σ《镜霓D(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生相反作用，且 PCAF 特異性 siRNA 會增加病毒轉(zhuǎn)錄。K31 和 K90 位于 RNA 結(jié)合溝的對面。這兩個事實表明，K90 的 GCN5 乙?；纳镒饔门c K31 的 PCAF 乙?；煌８鶕?jù)先前的 NP 相互作用研究，作者進一步表明 SMARCA2 和 SMARCA4 對乙酰賴氨酸結(jié)合域的作用。

Marcos-Villar 等人的相關(guān)研究報告了在流感感染期間能更全面地了解 DNA 和組蛋白水平 [PMID：29352168]。DNA 甲基化未受影響，但組蛋白 H3 和 H4 甲基化水平 H3K4me3 則降低，而 H3K36 (me0)、H4K20me2 和 H3K79me2 則增加。這些變化與轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。DOT1L 抑制劑(用量為 1 微摩爾)或(特異性)shRNA 均會降低 H3K79me2 和增加流感病毒的復(fù)制。一項更詳細的針對發(fā)生流感感染后 DOT1L 的作用的研究表明，DOT1L 下調(diào)會導(dǎo)致 NF-κB 復(fù)合體核轉(zhuǎn)位減少以及 IFNβ 和 ISG(Mx1 和 ISG56)的表達降低。此外，DOT1L 抑制不會影響缺乏 IFN 通路的流感感染細胞。

代謝疾病表觀遺傳學(xué)

維生素 D 受體

對源自人體 iPS 細胞的 β 樣細胞進行了一次無偏倚 CRISPR 篩查，且隨后的基因本體論 (GO) 分析確認了與染色質(zhì)修飾、細胞周期和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因 [PMID：29754817]。維生素 D 受體 (VDR) 是最富集的基因靶標(biāo)之一(7 個 sgRNA 中有 6 個在 GFP 細胞中發(fā)現(xiàn))。包含 shRNA 敲減 VDR 的 iPS 細胞系分化成 β 樣細胞，并經(jīng) IL1β 處理。這些細胞更容易發(fā)生細胞因子誘導(dǎo)的細胞死亡。對 VDR 作用的進一步研究發(fā)現(xiàn)了互作蛋白 BRD9 和 BRD7。BRD9 與帶 HA 標(biāo)簽的 VDR 和內(nèi)源性 VDR 發(fā)生免疫共沉淀。研究發(fā)現(xiàn)，這種相互作用發(fā)生在 BRD9 溴結(jié)構(gòu)域，且在有 VDR 配體(鈣泊三醇)的情況下減弱。BRD9 拮抗劑 I-BRD9 也會降低 BRD9 與 VDR 之間的相互作用強度。LC/MS/MS 數(shù)據(jù)以及突變研究均表明，VDR-K91ac 對與 BRD9 的相互作用很重要。盡管帶 HA 標(biāo)簽的 VDR 與 Flag 標(biāo)簽的 BRD7 結(jié)合，但添加 VDR 配體或 VDR 配體和 I-BRD9 會增強它們的相互作用。這表明 BRD9 和 BRD7 競爭性結(jié)合 VDR。根據(jù)先前的研究，PCAF 被列為 VDR-K91ac 乙酰基轉(zhuǎn)移酶，且與野生型 PCAF 而非 D608A(酶死亡)突變體增加的 VDR-K91ac 相符。破壞與 BRD9 的相互作用，將平衡移向 PBAF 與結(jié)合 BRD7。

糖原合酶激酶 3γ (GSK3γ)

糖原合酶激酶 3γ (GSK3γ) 調(diào)節(jié)糖原合酶，并且近期被證實參與 OC 骨吸收以及對前列腺癌細胞的腫瘤抑制。這種激酶的活性增加還與 2 型糖尿病 (T2D) 有關(guān)。作者發(fā)現(xiàn)，BRD7 蛋白表達升高會導(dǎo)致 mTOR 依賴性模型中的 GSK3b 磷酸化增加(即使在缺乏 AKT1/2 激酶活性的情況下)[PMID：29127434]。(BRD7 過度表達同時阻斷 AKT 和 mTOR 的活性不會增加 GSK3b 的磷酸化。)BRD7 在缺乏 AKT 活性時會調(diào)節(jié) GSK3γ-S9 磷酸化，并啟動核糖體蛋白 S6 激酶磷酸化的鏈反應(yīng)，這可導(dǎo)致 4E-BP1 磷酸化增加，從而解除其對 eIF4E 的抑制。在缺乏 AKT 活性且 BRD7 過度表達的情況下，4E-BP1 磷酸化較弱。通過使用肝臟特異性 BRD7 KO 小鼠，作者表明 BRD7 是 mTORC1 保持在與其下互作蛋白上活性所必需的。

標(biāo)簽：