子孢子肝浸潤(rùn)抗體

脊椎動(dòng)物宿主的瘧疾感染始于被感染的蚊子在其皮膚中沉積孢子。然后，子孢子進(jìn)入循環(huán)，通過子孢子表面的周孢子蛋白(CSP)與肝血竇中的糖胺聚糖(GAGs)之間的強(qiáng)相互作用，迅速捕獲肝血竇。首次報(bào)道子孢子CSP與肝臟GAGs的結(jié)合發(fā)生在肝細(xì)胞基底部分之外(Frevert等，1993；Cerami等人，1994年)。隨后的研究證實(shí)，子孢子CSP與星狀細(xì)胞合成的GAGs結(jié)合，并通過內(nèi)皮腔突出到血管腔中(Pradel等人，2002)。這種相互作用不是宿主細(xì)胞識(shí)別的義務(wù)(Frevert等人，1996年)。顯微研究表明，子孢子主要通過枯否細(xì)胞離開循環(huán)(Meis等，1983，1985；Vreden，1994年；Pradel和Frevert等人，2001年)是竇內(nèi)襯的一部分，隨后是潛在肝細(xì)胞的感染(Frevert等人，2005年)。在隨后的研究中，使用了細(xì)胞內(nèi)共聚焦顯微鏡和在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠細(xì)胞系，這提供了孢子也可以通過內(nèi)皮細(xì)胞離開循環(huán)的證據(jù)(Tavares等人，2013年)。最近，枯否細(xì)胞CD68被鑒定為孢子體受體，這表明優(yōu)先孢子體與枯否細(xì)胞相互作用的分子基礎(chǔ)。在cd68敲除小鼠中，與野生型小鼠相比，小鼠的肝臟侵襲減少了70%以上(Cha等人，2015年)。

CD68作為子孢子受體的鑒定來自從噬菌體文庫(kù)中篩選的三種肽-p39、P61和P52(Cha等人，2015)。這些肽不僅選擇性結(jié)合庫(kù)普弗細(xì)胞表面，而且競(jìng)爭(zhēng)性抑制庫(kù)普弗細(xì)胞進(jìn)入肝實(shí)質(zhì)。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，這些與枯否細(xì)胞表面CD68蛋白結(jié)合的肽是瘧原蟲GAPDH在孢子表面的模擬表位(結(jié)構(gòu)模擬物)。CD68和pGAPDH之間存在直接的相互作用，這對(duì)于庫(kù)普弗細(xì)胞的子孢子穿越非常重要(Cha等人，2016)。

GAPDH除了在糖酵解中發(fā)揮主要作用外，還被認(rèn)為是候選疫苗，因?yàn)樗霈F(xiàn)在幾種病原微生物的表面，并作為宿主細(xì)胞識(shí)別和入侵的配體(潘喬李菲舍蒂等，1992，1997；Argiro等人，2000年；Rosinha等人，2002年；博格曼等人，2004年；Boel等人，2005年)。由于GAPDH在進(jìn)化過程中是保守的，其氨基酸序列在病原體和高等生物之間高度相似，用全蛋白作為疫苗抗原是不現(xiàn)實(shí)的。因此，確定能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性抗體的寄生蟲的gap-dh特異性表位非常重要(Perez-Casal Potter，2016)。我們的研究表明，用klh標(biāo)記的P39肽(一種GAPDH mimo壁)免疫小鼠可以獲得很強(qiáng)的保護(hù)性免疫，而抗P39血清可以識(shí)別a GAPDH的蛋白。在這里，我們報(bào)道了一種表位定位方法，用于通過使用抗p39抗體來鑒定作為保護(hù)性表位的berghei GAPDH (PbGAPDH)的結(jié)構(gòu)域。我們表明PbGAPDH獨(dú)特的保護(hù)性表位位于蛋白質(zhì)的C端，預(yù)計(jì)位于折疊蛋白質(zhì)的暴露口袋中。

結(jié)果

多壁多肽P39、P61和P52作為免疫原性抗原保護(hù)伯氏瘧原蟲子孢子免受感染的評(píng)價(jià)

通過噬菌體展示肽庫(kù)，我們發(fā)現(xiàn)了三種肽-p39、P61和p52-它們與庫(kù)普弗細(xì)胞結(jié)合，并以這種方式強(qiáng)烈抑制子孢子的結(jié)合和進(jìn)入(Cha等人，2015)。我們還發(fā)現(xiàn)P39肽免疫可以有效保護(hù)小鼠免受蚊蟲叮咬引起的伯氏平孢子蟲感染。圖1A顯示抗p39抗體可以識(shí)別與GAPDH具有相同流動(dòng)性的子孢子蛋白。然而，另外兩個(gè)肽p61和p52尚未被鑒定。我們用klh標(biāo)記合成的多壁多肽免疫小鼠。所有三種肽的抗體都能識(shí)別重組pGAPDH(圖1B)。然而，每種肽似乎都模擬了PbGAPDH的不同表位(圖1C)。接下來，我們?cè)u(píng)估了每種候選mimo壁抗原的免疫原性和保護(hù)潛力。用三種多壁抗原的單一或不同組合免疫小鼠。然而，各組的總抗體濃度沒有顯著差異，P39的特異性免疫原性明顯高于P52(圖2A)。每次免疫后，兩只感染的按蚊叮咬挑戰(zhàn)貝氏按蚊。與klh免疫組相比，P39肽的免疫保護(hù)作用最強(qiáng)，對(duì)子孢子感染的抑制率為67%(圖2B)。這些初始數(shù)據(jù)表明P39具有最強(qiáng)的保護(hù)潛力，因此它被用于所有后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

(a)抗p39抗體在伯氏瘧原蟲子孢子裂解物的蛋白質(zhì)印跡中特異性識(shí)別PbGAPDH。雨披染色和抗肌動(dòng)蛋白抗體作為負(fù)荷對(duì)照?！癝”:從受感染的千金藤唾液腺中純化的子孢子的裂解物；“M”:從斯蒂芬斯未感染的唾液腺中提取的假裂解物?？筩sp抗體作為子孢子裂解物的陽性對(duì)照。多克隆抗pbgapdh抗體(紅色箭頭)以與抗p39帶相同的遷移率識(shí)別子孢子gapdh帶。(b)每個(gè)mimo壁多肽(P39、P61和P52)的抗體識(shí)別具有相同的流程。

動(dòng)性的條帶為PbGAPDH(紅色箭頭)，而不是pET標(biāo)記蛋白(藍(lán)色箭頭)。每個(gè)面板顯示兩個(gè)通道，左邊僅包含pET標(biāo)記蛋白，右邊是標(biāo)記的重組PbGAPDH蛋白。用于檢測(cè)印跡的抗體顯示在每個(gè)面板底部?？箻?biāo)記和抗klh抗體分別作為陽性和陰性對(duì)照。用抗小鼠GAPDH抗體作為陽性對(duì)照，鑒定GAPDH蛋白。重組蛋白和標(biāo)記蛋白的位置由右側(cè)箭頭指示。所有的數(shù)據(jù)都代表了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。(C)每個(gè)抗肽抗體都明確識(shí)別其自身的肽。顯示在每個(gè)面板頂部的生物素化肽與鏈霉親和素涂層的ELISA板的孔結(jié)合，并被每個(gè)面板底部的抗體結(jié)合測(cè)試。沒有發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)的證據(jù)。所有數(shù)據(jù)都代表兩個(gè)獨(dú)立的化驗(yàn)。

mimo墻面多肽作為保護(hù)P·伯格伊感染的抗原的評(píng)估。

(一)肽免疫原性。小鼠免疫與單一抗原(50μg KLH-conjugated肽),結(jié)合兩個(gè)抗原(25μg每個(gè)),或三種抗原的結(jié)合(16.7μg每個(gè)),表示。每隔2周注射三針后，用ELISA法測(cè)定每只小鼠產(chǎn)生的特異性抗體數(shù)量。頂部面板:總抗體濃度。每組小鼠的數(shù)量用括號(hào)表示。底部面板:特定抗體濃度。所有的數(shù)據(jù)都代表了兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。錯(cuò)誤條表示SD。(B)肽免疫預(yù)防感染。接種疫苗的小鼠受到兩只被感染的史蒂芬尼蚊子的叮咬。用薄血涂片和姬姆沙染色法測(cè)定感染的流行程度，直到感染后12天。被感染小鼠的數(shù)量/被感染小鼠的數(shù)量和%的抑制在每個(gè)面板的底部。數(shù)據(jù)來自三個(gè)(單個(gè)抗原)或四個(gè)(混合抗原)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。P值(*P < 0.05);* * P < 0.01;***P < 0.001)采用單因素方差分析(A)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)(B)計(jì)算，(A)每組小鼠數(shù)與(B)每組小鼠數(shù)相同。