抗原抗體雜交法（抗原抗體雜交）

關于抗原抗體雜交法，抗原抗體雜交這個問題很多朋友還不知道，今天小六來為大家解答以上的問題，現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！

1、抗原抗體雜交就是Western雜交，原理　　Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質的檢測方法。

2、其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。

3、先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質樣品溶解于含有去污劑和還原劑的溶液中，經(jīng)SDS-PAGE電泳將蛋白質按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。

4、然后加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合后，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最后通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。

5、根據(jù)檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。

6、 　　Western 雜交技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯酰胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Southern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合后，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。

7、Western雜交方法靈敏度高，通?？蓮闹参锟偟鞍字袡z測出50ng的特異性的目的蛋白。

8、編輯本段試劑配制　　(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0 　　150mmol/L 甘氨酸 　　加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸于4L水中，加入1200mL 　　甲醇，加水至6L 　　(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S 　　1%乙酸編輯本段操作步驟：　　(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。

9、 　　(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。

10、 　　(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。

11、 　　(4)將以上“三明治”樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。

12、 　　(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。

13、 　　(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鐘，蛋白染色水中脫色2分鐘，照像，用印度墨水將分子量標準染色，在水中完全脫色。

14、 　　(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。

15、 　　(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入后室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。

16、 　　(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。

17、 　　(10)將濾膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大約2～3分鐘就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。

18、 　　結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據(jù)信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

本文分享完畢，希望對大家有所幫助。

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