賓夕法尼亞州立大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的跨學(xué)科研究人員團隊已經(jīng)開發(fā)出提高CRISPR-Cas9效率的技術(shù)，CRISPR-Cas9是一種基因組編輯技術(shù)，在2020年獲得了諾貝爾獎。雖然CRISPR-Cas9比其他基因編輯方法更快，更便宜，更準確，但根據(jù)賓夕法尼亞州立大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程和生物學(xué)副教授小軍“Lance”Lian的說法，該技術(shù)存在局限性 - 特別是在改善人類健康的應(yīng)用中。
研究人員開發(fā)了一種更有效和更容易獲得的過程，將CRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用于人類多能干細胞(hPSCs)，來自聯(lián)邦批準的干細胞系，Lian說這可以大大推進遺傳疾病的診斷和治療。該方法于9月7日發(fā)表在《細胞報告方法》上。
CRISPR-Cas9代表簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列和CRISPR相關(guān)蛋白9，使科學(xué)家能夠靶向遺傳密碼的精確位置以改變DNA，從而提供了創(chuàng)建新的診斷工具和潛在糾正突變的機會，以治療疾病的遺傳原因。
“人類基因組是巨大的，CRISPR-Cas9使科學(xué)家有可能發(fā)現(xiàn)并靶向突變基因以進行研究，”Lian說。
CRISPR使用稱為質(zhì)粒DNA的遺傳物質(zhì)盤來遞送引導(dǎo)的核糖核酸(RNA)，該核糖核酸(RNA)將Cas9酶定位在靶基因的精確位置。當(dāng)DNA被定位時，Cas9與它結(jié)合并切割出來，允許其他DNA修復(fù)切割。然后，研究人員可以看到去除如何改變基因的表達。但根據(jù)Lian的說法，目前基于DNA的CRISPR方法存在遞送和編輯效率問題。
“DNA CRISPR效應(yīng)子的遞送很低，”他說。“使用CRISPR時，只有20%到30%的靶細胞會接受基因編輯DNA。將RNA遞送到細胞中可以更有效;然而，當(dāng)引入常規(guī)RNA時，細胞可以將其視為病毒。他們在RNA制造蛋白質(zhì)之前破壞RNA- 比如說，在幾個小時內(nèi) - 并且這樣做會破壞基因編輯的嘗試。
為了改善結(jié)果，研究人員改變了基因組編輯工具被遞送到干細胞的方式，使用修飾的RNA(modRNA)。modRNA與質(zhì)粒DNA的不同之處在于，它用化學(xué)修飾的版本替換了RNA中發(fā)現(xiàn)的一種堿基底物，并且通過更強的結(jié)構(gòu)支持來穩(wěn)定它。
“發(fā)現(xiàn)modRNA明顯比質(zhì)粒DNA更有效，”Lian說。“大約90%的細胞從簡單的轉(zhuǎn)染中接收modRNA，因此它能夠保持在原位并完成其工作。
研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA存在的時間是理想的：足夠長的時間來修飾細胞，但不會太長以至于它會導(dǎo)致脫靶活性。但ModRNA引入了另一個問題，據(jù)Lian說。
當(dāng)modRNA Cas9成功遞送到靶基因時，它會在基因組中產(chǎn)生雙鏈斷裂，一些細胞會試圖修復(fù)。那些修復(fù)自己的人可以將修復(fù)或“突變”傳遞給他們的后代。這是研究人員想要更好地了解的過程，所以這些是他們想要收獲和研究的細胞。Lian說，問題在于，大多數(shù)有這種斷裂的細胞都將其視為基因組的主要問題，并且會自毀而不是試圖修復(fù)自己。
為了減少Cas9的毒副作用并幫助編輯的細胞存活，Lian的團隊引入了一種已知可以幫助細胞生長的小蛋白質(zhì)。根據(jù)Lian的說法，這種添加的蛋白質(zhì)抑制了細胞死亡，并將Cas9編輯效率提高了84%。
研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA可以改善其他基因編輯技術(shù)，如堿基編輯。堿基編輯可以通過使用蛋白質(zhì)來改變單個核苷酸來敲除基因或糾正基因組中的突變，而不是像CRISPR那樣切割兩條鏈。
“我們用基于質(zhì)?；蚧趍odRNA的堿基編輯蛋白轉(zhuǎn)染干細胞，”Lian說。“我們基于modRNA的方法在成功編輯基因組方面的效率是基于質(zhì)粒的技術(shù)的四倍多，為68%，約為16%。
Lian認為，隨著更多的基因編輯實驗室提高基因編輯效率和有效性，研究人員將能夠更快地更好地了解基因及其功能。
“人體有超過20，000個基因，但我們只研究了其中約10%的功能，”Lian說。“檢查每個剩余基因的目的，一次一個，可能需要一生的時間。使用來自我們高效基因編輯技術(shù)的工程干細胞可以大大加快這一過程。
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