從微量樣品中解碼生物分子的身份是生物技術(shù)領(lǐng)域的一個長期目標(biāo)，雖然下一代測序技術(shù)已經(jīng)可以識別單個DNA和RNA分子，但同樣的功能尚無法用于蛋白質(zhì)。但哈佛大學(xué)維斯研究所、哈佛醫(yī)學(xué)院布拉瓦尼克研究所(HMS)和波士頓兒童醫(yī)院(BCH)分子機器人計劃的科學(xué)家們現(xiàn)在已經(jīng)利用DNA創(chuàng)造了他們所說的世界上最小的統(tǒng)治者。測量蛋白質(zhì)。
該技術(shù)被稱為“DNA納米開關(guān)卡尺”(DNC)，使研究人員能夠通過施加少量的力對單個肽進行高精度距離測量。通過對同一分子快速進行多次距離測量，DNC創(chuàng)建了一個獨特的“指紋”，可用于在后續(xù)實驗中識別同一分子。
“當(dāng)你試圖理解生物學(xué)中的某些東西時，有兩種主要的探究方法：你可以觀察自然狀態(tài)下的研究對象，或者你可以擾亂它并觀察它的反應(yīng)，”助理研究員韋斯利·黃博士說Wyss研究所的教員和HMS的副教授，同時也是BCH的研究員。“觀察可以提供大量重要的生物信息，但有時了解某些事物的最佳方法是與其進行身體互動。通過施加力來確定肽分子內(nèi)氨基酸的模式是正在進行的科學(xué)探索中的一個新范例，這些技術(shù)將使我們能夠像目前對DNA進行測序一樣輕松地對蛋白質(zhì)進行測序。”
Wong是該團隊在《自然納米技術(shù)》上發(fā)表的論文的通訊作者，論文題為“使用DNA納米開關(guān)卡尺進行單分子機械指紋識別”。
蛋白質(zhì)在幾乎所有生物過程中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，但這些分子比DNA和RNA復(fù)雜得多，并且經(jīng)常經(jīng)過化學(xué)修飾，這使得樣品中單個蛋白質(zhì)(單分子蛋白質(zhì)組學(xué))的識別具有挑戰(zhàn)性。作者寫道：“DNA分析的進步極大地影響了臨床實踐和基礎(chǔ)研究，但蛋白質(zhì)的相應(yīng)發(fā)展由于其相對復(fù)雜性和我們無法放大它們而面臨挑戰(zhàn)。”“一種準(zhǔn)確、全面分析痕量樣品中蛋白質(zhì)的方法將影響從診斷到細胞生物學(xué)的各個領(lǐng)域，但仍然是一個極具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)......盡管質(zhì)譜法和質(zhì)譜流式細胞術(shù)等方法取得了進展，但單分子蛋白質(zhì)鑒定仍然是一個極具挑戰(zhàn)性的目標(biāo)客觀的。”
DNC基于DNA納米開關(guān)的底層技術(shù)。實際上，這是一條單鏈DNA，在其長度上的多個點上附有分子“手柄”。當(dāng)其中兩個手柄相互結(jié)合時，它們會在DNA鏈中形成一個環(huán)，并且鏈的總長度會縮短。當(dāng)用力將手柄拉開時，線繩會延伸回其原始長度。處于環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)的線的長度之間的差異反映了環(huán)的尺寸，從而反映了手柄之間的距離。
研究小組意識到他們可以將DNA納米開關(guān)更進一步。如果他們將手柄設(shè)計為與生物分子結(jié)合，那么手柄可以像卡尺的兩個尖端一樣有效地在它們之間“夾住”分子，而不是相互結(jié)合。通過測量在手柄之間添加目標(biāo)分子如何改變DNA納米開關(guān)在環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)下的總長度，研究小組假設(shè)他們可以有效地測量分子的大小。
“在某些方面，DNA納米開關(guān)利用了一種最經(jīng)典的機械方法來測量物體：只需對某物施加力，然后觀察它的反應(yīng)如何變化，”共同第一作者、Wyss博士后研究員DarrenYang博士說。研究所和BCH。“我們還沒有真正看到這種方法用于單分子蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域，因為對如此小的物體施加力是非常具有挑戰(zhàn)性的。但我們迎接了挑戰(zhàn)。”
為了將他們的基于力的新測量技術(shù)的想法變?yōu)楝F(xiàn)實，Yang和同事首先將兩種不同類型的手柄連接到目標(biāo)分子：一個“強”手柄將分子牢固地錨定在DNC的一端，以及多個手柄?？梢赃B接到DNC另一端的“弱”手柄。然后，他們將DNC的兩端拴在兩個懸浮在激光束中的光學(xué)捕獲珠上。通過將珠子移得更近，他們誘導(dǎo)目標(biāo)分子的弱手柄之一與DNC結(jié)合，形成環(huán)狀狀態(tài)。然后，當(dāng)他們通過將珠子進一步移開來增加力量時，弱手柄最終釋放了其鍵合??，使DNC恢復(fù)到更長的、未成環(huán)的狀態(tài)。”
“DNA納米開關(guān)是在特定位點裝飾的DNA系鏈，其功能可以直接相互結(jié)合或通過第三個橋接復(fù)合物結(jié)合，”作者解釋道。“結(jié)合導(dǎo)致納米開關(guān)的一部分環(huán)出，縮短了系鏈長度;當(dāng)這些鍵斷裂時，系鏈會延伸回原來的長度……本質(zhì)上，從環(huán)狀結(jié)構(gòu)到非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的長度變化反映了閉合環(huán)的分子橋的大小——橋越大，長度變化越小”。
該團隊首先在簡單的單鏈DNA(ssDNA)分子上測試了DNC技術(shù)，并證實DNC的環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)之間的距離測量變化與目標(biāo)分子的長度直接相關(guān)。這些長度變化可以以埃級精度(比DNA雙螺旋寬度小十倍)進行測量，從而能夠識別與單個核苷酸一樣小的長度變化。
由于目標(biāo)分子包含多個可以與DNC結(jié)合的弱手柄，因此結(jié)合和破壞這些手柄的重復(fù)循環(huán)會在強手柄和弱手柄之間產(chǎn)生一系列距離測量值，這些距離測量值對于每個測量的分子來說是唯一的。這種“指紋”可用于識別樣品中的已知分子，或推斷未知分子的結(jié)構(gòu)信息。
在確認DNC可以可靠地測量DNA分子的大小后，研究人員將注意力轉(zhuǎn)向蛋白質(zhì)。他們設(shè)計了一種已知長度和序列的合成肽，并重復(fù)實驗，通過強手柄將其連接到DNC的一端，并通過施加不同大小的力反復(fù)連接和破壞其弱手柄和DNC之間的鍵。
他們發(fā)現(xiàn)，他們的工具測量的強手柄和弱手柄之間的所有距離都與根據(jù)DNC長度和肽中氨基酸長度預(yù)期的距離相匹配。當(dāng)他們使用DNC測量天然存在的線性化肽NOXABH3時，也得到了類似的結(jié)果。
該過程還為每種肽生成了獨特的測量指紋。“對單個分子進行多次距離測量可以創(chuàng)建可用于蛋白質(zhì)識別的機械指紋……”他們寫道。該團隊創(chuàng)建了一個計算機模型來預(yù)測使用這種方法可以唯一識別多少人類蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)常用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中超過75%的蛋白質(zhì)可以通過指紋識別，概率至少為90%。
“實際上，我們對這項技術(shù)的效果感到有些驚訝，”共同第一作者、Wyss研究所和BCH的博士后研究員PrakashShrestha博士說。“光鑷已經(jīng)存在了幾十年，而在環(huán)狀和非環(huán)狀狀態(tài)之間循環(huán)DNA也已經(jīng)存在了大約10年，我們不確定是否可以通過結(jié)合這些想法來獲得足夠高分辨率的測量。但事實證明，這些指紋對于識別蛋白質(zhì)非常有效。”
識別單個蛋白質(zhì)分子本身就是一項令人印象深刻的壯舉，但能夠同時識別多個蛋白質(zhì)才是單分子蛋白質(zhì)組學(xué)的真正圣杯。該團隊進一步證明，通過用磁鑷系統(tǒng)替換光珠，他們能夠并行測量多種不同的肽，并確定不同分子的相對濃度。他們寫道：“使用光鑷，我們展示了對DNA和肽的埃級精度的絕對距離測量，并使用多重磁性鑷子，我們展示了混合樣品中相對豐度的量化。”
“我們還展示了如何通過在多路磁鑷系統(tǒng)上實施該測定來通過并行化來提高通量。這使我們能夠測量異質(zhì)混合物中不同比例的肽的相對濃度。”
共同通訊作者WilliamShih博士是Wyss研究所的核心教員，同時也是HMS和Dana-Farber癌癥研究所的教授，他進一步評論道：“由于規(guī)模化和分辨率方面的挑戰(zhàn)，單分子蛋白質(zhì)組學(xué)在很大程度上仍然是一個白日夢。。我們目前的工作表明，基于力的序列指紋識別有潛力實現(xiàn)這一夢想。我們的最終目標(biāo)不僅是高效讀取蛋白質(zhì)序列，還以高通量方式有效讀取蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。”
科學(xué)家們實現(xiàn)這一目標(biāo)的下一步是驗證他們的卡尺對折疊蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的低力結(jié)構(gòu)測量，研究它們在結(jié)構(gòu)生物學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)中的潛在用途。他們寫道：“DNC有可能用于測量蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)中多個殘基之間的距離，這將能夠表征生物分子和生物分子復(fù)合物的動態(tài)3D結(jié)構(gòu)，補充現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)闡明生物物理方法。”
該團隊還致力于提高該技術(shù)的吞吐量，以進一步加快混合樣品的分析速度。“DNC還可以集成到其他力譜方法中，以納入額外的功能或提高動態(tài)范圍、空間精度或吞吐量，”他們建議。“DNC提供了一種強大的方法來表征納米級復(fù)合物內(nèi)的距離和幾何形狀，有可能影響從蛋白質(zhì)組學(xué)和納米技術(shù)到結(jié)構(gòu)生物學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)的廣泛領(lǐng)域。”
“這項研究將分子生物物理學(xué)與Wyss研究所首創(chuàng)的尖端DNA納米技術(shù)相結(jié)合，使我們能夠以一種真正新穎的方式與生物分子相互作用并進行分析，”Wyss創(chuàng)始人、醫(yī)學(xué)博士、哲學(xué)博士DonIngber說道。JudahFolkman是哈佛醫(yī)學(xué)院和BCH血管生物學(xué)教授，也是哈佛大學(xué)約翰·A·保爾森工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物工程教授。“當(dāng)威廉和韋斯利第一次將這個想法作為新成立的分子機器人計劃的核心挑戰(zhàn)時，它確實看起來像是科幻小說，但這正是我們想要在Wyss開展的項目類型。我為團隊使這項技術(shù)成為現(xiàn)實感到非常自豪——它有可能徹底改變我們進行科學(xué)研究和開發(fā)治療方法的方式。”
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