伊利諾伊大學(xué)比爾梅特卡夫微生物學(xué)教授g .威廉阿倫茲和博士后研究員迪皮蒂納亞克的一項(xiàng)新研究首次記錄了CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯在生命的第三個(gè)領(lǐng)域——古細(xì)菌中的應(yīng)用。他們發(fā)表在《美國國家科學(xué)院院刊》上的開創(chuàng)性工作可能會(huì)大大加速這些生物的未來研究，并對(duì)包括全球氣候變化在內(nèi)的研究產(chǎn)生影響。梅特卡夫和納亞克是伊利諾伊州卡爾沃爾斯基因組生物學(xué)研究所的成員。
“在大多數(shù)情況下，與大腸桿菌相比，我們的模式古細(xì)菌醋酸甲烷八疊球菌的倍增時(shí)間為8至10小時(shí)，大腸桿菌可以在大約30分鐘內(nèi)倍增。這意味著遺傳和獲得突變體可能需要幾個(gè)月的時(shí)間——同樣的事情在大腸桿菌中需要三天，”納亞克解釋說?！霸诜浅；镜膶用嫔?，CRISPR-Cas9讓我們能夠做到的是加快整個(gè)流程。它消除了一個(gè)主要瓶頸.用這個(gè)古細(xì)菌做基因研究的時(shí)候。
“更有甚者，”納亞克繼續(xù)說道，“通過我們以前的技術(shù)，突變必須一步一步引入。利用這項(xiàng)新技術(shù)，我們可以同時(shí)引入多個(gè)突變。我們可以利用CRISPR擴(kuò)大突變體生成的過程?！?
CRISPR是簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)的縮寫，它開始作為古細(xì)菌和細(xì)菌的免疫防御系統(tǒng)。Cas(CRISPR相關(guān)系統(tǒng))蛋白通過識(shí)別和儲(chǔ)存外源DNA的短片段，可以在未來快速識(shí)別DNA，從而快速破壞，保護(hù)機(jī)體免受病毒入侵。
自從被發(fā)現(xiàn)以來，免疫系統(tǒng)的一個(gè)版本——CRISPR-Cas9——已經(jīng)被修改以在實(shí)驗(yàn)室編輯基因組。通過將Cas9與特定的工程RNA導(dǎo)向的而不是侵入性的DNA片段配對(duì)，可以引導(dǎo)CRISPR系統(tǒng)在任何位置切割細(xì)胞基因組，從而去除現(xiàn)有基因或添加新基因。該系統(tǒng)在編輯來自酵母、植物、魚類甚至人類細(xì)胞的真核系統(tǒng)方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，獲得了美國科學(xué)促進(jìn)會(huì)2015年度突破獎(jiǎng)。然而，其在原核物種中的實(shí)施遇到了障礙，部分原因是其不同的細(xì)胞過程。
為了在細(xì)胞系統(tǒng)中使用CRISPR，研究人員必須開發(fā)一種方案，該方案考慮到細(xì)胞首選的DNA修復(fù)機(jī)制：在CRISPR的“分子剪刀”切割染色體后，細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)通過一種機(jī)制介入修復(fù)損傷。其他遺傳物質(zhì)可以通過。在真核細(xì)胞中，這采取非同源末端連接的形式(NHEJ)。雖然這種方法已經(jīng)被用于CRISPR介導(dǎo)的編輯，但它有一種傾向，即在其修復(fù)過程中引入遺傳錯(cuò)誤：核苷酸，DNA階梯的步驟，通常在切割位點(diǎn)添加或刪除。
NHEJ在原核生物中非常罕見，包括古細(xì)菌；相反，它們的DNA通常通過一種叫做同源定向修復(fù)的過程進(jìn)行修復(fù)。通過比較DNA模板的損傷，同源定向修復(fù)創(chuàng)造了Nayak所說的“確定性模板”——最終結(jié)果可以提前預(yù)測，并根據(jù)研究人員的確切需求進(jìn)行調(diào)整。
在許多方面，同源定向修復(fù)實(shí)際上更適合基因組編輯：“雖然我們希望CRISPR-Cas9在真核系統(tǒng)中被定向編輯，但因?yàn)镹HEJ，我們經(jīng)常得到我們不想要的東西，”Nayak解釋說?！霸谶@方面，大部分古細(xì)菌菌株不具備非同源末端連接的修復(fù)系統(tǒng)是一件好事，所以DNA能夠修復(fù)的唯一途徑就是通過這種確定性的同源修復(fù)途徑?！?
雖然看似違反直覺，納亞克和梅特卡夫首先使用CRISPR-Cas9將NHEJ機(jī)制引入甲烷八疊球菌。納亞克說，盡管基因組編輯通常不受歡迎，但NHEJ有一個(gè)優(yōu)于同源修復(fù)的用途：“如果你只想刪除一個(gè)基因，如果你不在乎如何刪除.非同源末端連接實(shí)際上更有效?！?
通過使用引入的NHEJ修復(fù)系統(tǒng)的所謂“敲除”研究，其中單個(gè)基因被移除或沉默，以觀察基因可能影響的變化和過程，納亞克說，未來的研究將能夠組裝醋桿菌和其他古老物種的遺傳圖譜。這樣的圖譜對(duì)于涉及古細(xì)菌的各種研究領(lǐng)域非常有用，包括梅特卡夫?qū)嶒?yàn)室特別感興趣的領(lǐng)域，即氣候變化。
“甲烷八疊球菌是最具遺傳性的古老菌株之一，”納亞克說?！癧產(chǎn)甲烷細(xì)菌]是一種古生物，每年都會(huì)產(chǎn)生這種強(qiáng)大的溫室氣體。它在全球碳循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，因此對(duì)全球氣候變化做出了重大貢獻(xiàn)。”通過研究這種生物和類似生物的遺傳學(xué)，納亞克和梅特卡夫不僅希望對(duì)古菌遺傳學(xué)有更深入的了解，還希望獲得它們?cè)诟鼜V泛的環(huán)境過程中的作用。
總之，這項(xiàng)研究代表了一個(gè)令人興奮的研究和操縱古細(xì)菌的新方向?！拔覀冮_始這項(xiàng)研究是為了確定CRISPR-Cas9基因組編輯是否可以用于古菌，”Nayak總結(jié)道?！拔覀儼l(fā)現(xiàn)，與真核系統(tǒng)相比，這不僅是可能的，而且非常有效。”
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